The HypB protein from Bradyrhizobium japonicum can store nickel and is required for the nickel-dependent transcriptional regulation of hydrogenase

Resumo

A proteína HypB de Bradyrhizobium japonicum é uma GTPase de ligação a metais necessária para a expressão da hidrogenase. A mutagênese in-frame da hypB resultou em cepas parcial ou totalmente deficientes na expressão da hidrogenase, dependendo do grau de interrupção do gene. A deleção completa do gene produziu uma cepa (JHΔEg) que não tinha atividade de hidrogenase em todas as condições testadas, inclusive na situação de bacteroides de nódulos de soja. A cepa mutante JHΔ23H, sem apenas a região N-terminal rica em histidina (38 aminoácidos excluídos, 23 dos quais são resíduos de His), expressou atividade parcial de hidrogenase. A atividade da cepa JHΔ23H era baixa em comparação com o tipo selvagem em níveis de níquel de 10 a 50 nM, mas podia ser tratada para níveis quase do tipo selvagem com a inclusão de 50 μM de níquel durante a incubação de desrepressão. Estudos em cepas com a incorporação do plasmídeo de fusão hup promoter-lacZ mostraram que a exclusão completa de hypB praticamente aboliu a atividade do promotor hup, enquanto o mutante de exclusão de histidina apresentou 60% da atividade do promotor do tipo selvagem em 50 μM NiCl2. Outras evidências de que o HypB é necessário para a atividade de ligação do promotor hup foram obtidas em ensaios de deslocamento em gel. O HypB não pôde ser detectado por imunotransferência quando as células foram cultivadas heterotroficamente, mas quando houve uma mudança para condições microaeróbicas (1% de pressão parcial de O2, 10% de pressão parcial de H2), o HypB foi detectado e sua expressão precedeu a síntese de hidrogenase em 3-6 h. O acúmulo de 63Ni por células inteiras mostrou que ambas as cepas mutantes acumulam menos níquel do que a cepa do tipo selvagem em todos os momentos testados durante a incubação de desrepressão. As culturas do tipo selvagem que receberam níquel durante o período específico de expressão do HypB e que, em seguida, foram lavadas e desreprimidas para hidrogenase sem níquel, tiveram atividades comparáveis às células que foram desreprimidas para hidrogenase com níquel durante todo o período. Em contraste com o tipo selvagem, as culturas da cepa JHΔ23H que receberam níquel somente durante o período de expressão do HypB alcançaram atividades de hidrogenase, que eram 30% das culturas que receberam níquel durante todo o período de supressão da hidrogenase. Esses resultados indicam que a perda da área de ligação a metais do HypB causa uma diminuição na capacidade das células de sequestrar e armazenar níquel para uso posterior em uma ou mais etapas de expressão da hidrogenase.

Abstract

The HypB protein from Bradyrhizobium japonicum is a metal-binding GTPase required for hydrogenase expression. In-frame mutagenesis of hypB resulted in strains that were partially or completely deficient in hydrogenase expression, depending on the degree of disruption of the gene. Complete deletion of the gene yielded a strain (JHΔEg) which lacked hydrogenase activity under all conditions tested, including the situation as bacteroids from soybean nodules. Mutant strain JHΔ23H lacking only the N-terminal histidine-rich region (38 amino acids deleted, 23 of which are His residues) expressed partial hydrogenase activity. The activity of strain JHΔ23H was low in comparison to the wild type in 10–50 nM nickel levels, but could be cured to nearly wild-type levels by including 50 μM nickel during the derepression incubation. Studies on strains harbouring the hup promoter–lacZ fusion plasmid showed that the complete deletion of hypB nearly abolished hup promoter activity, whereas the histidine deletion mutant had 60% of the wild-type promoter activity in 50 μM NiCl2. Further evidence that HypB is required for hup promoter-binding activity was obtained from gel-shift assays. HypB could not be detected by immunoblotting when the cells were cultured heterotrophically, but when there was a switch to microaerobic conditions (1% partial pressure O2, 10% partial pressure H2) HypB was detected, and its expression preceded hydrogenase synthesis by 3–6 h. 63Ni accumulation by whole cells showed that both of the mutant strains accumulate less nickel than the wild-type strain at all time points tested during the derepression incubation. Wild-type cultures that received nickel during the HypB expression-specific period and were then washed and derepressed for hydrogenase without nickel had activities comparable to those cells that were derepressed for hydrogenase with nickel for the entire time period. In contrast to the wild type, strain JHΔ23H cultures supplied with nickel only during the HypB expression period achieved hydrogenase activities that were 30% of those cultures supplied with nickel for the entire hydrogenase derepression period. These results indicate that the loss of the metal-binding area of HypB causes a decrease in the ability of the cells to sequester and store nickel for later use in one or more hydrogenase expression steps.