Characterization of in vitro Proton Pumping by Microsomal Vesicles Isolated from Corn Coleoptiles

Resumo

Foram isoladas vesículas microssomais de coleóptilos de milho (Zea mays L. cv Golden Cross Bantam) capazes de transportar H(+) impulsionado por ATP, conforme medido pelo acúmulo de metilamina[14C] e extinção da fluorescência da quinacrina. A formação do gradiente de pH in vitro mostra uma alta especificidade para o ATP.Mg, é sensível à temperatura, apresenta um pH ideal de 7,5 e é inibida pelo cianeto de carbonila-m-clorofenil-hidrazona. Dos cátions divalentes testados, o Mn(2+) é quase tão eficaz quanto o Mg(2+), enquanto o Ca(2+) é ineficaz. O excesso de cátions divalentes, especialmente o Ca(2+), reduz o gradiente de pH. O transporte de H(+) é fortemente promovido por ânions, especialmente o cloreto, enquanto o potássio não afeta a atividade da bomba. Estudos com 36Cl(-) indicam que o transporte de H(+) acionado por ATP para as vesículas está associado à captação de cloreto. Tanto o cianeto de carbonila-m-clorofenil-hidrazona quanto o inibidor do transporte de ânions, o ácido 4,4′-diisotiociano-2,2′-dissulfônico estilbeno, inibem o acúmulo de metilamina e a captação de 36Cl(-). O bombeamento de prótons também é bloqueado pelo dietilstilbestrol e pela N,N’-diciclohexilcarbodiimida, mas é insensível à oligomicina e ao vanadato. Essas propriedades da bomba são inconsistentes com uma origem mitocondrial ou de membrana plasmática.

Abstract

Corn (Zea mays L. cv Golden Cross Bantam) coleoptile microsomal vesicles have been isolated which are capable of ATP-driven H(+)-transport as measured by [(14)C]methylamine accumulation and quinacrine fluorescence quenching. Formation of the pH gradient in vitro shows a high specificity for ATP.Mg, is temperature-sensitive, exhibits a pH optimum at 7.5, and is inhibited by carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone. Of the divalent cations tested, Mn(2+) is almost as effective as Mg(2+), while Ca(2+) is ineffective. Excess divalent cations, particularly Ca(2+), reduces the pH gradient. H(+) transport is strongly promoted by anions, especially chloride, while potassium does not affect pump activity. Studies with (36)Cl(-) indicate that ATP-driven H(+) transport into the vesicles is associated with chloride uptake. Both carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone and the anion transport inhibitor, 4,4′-diisothiocyano-2,2′-disulfonic acid stilbene, inhibit methylamine accumulation and (36)Cl(-) uptake. Proton pumping is also blocked by diethyl stilbestrol and N,N’-dicyclohexylcarbodiimide, but is insensitive to oligomycin and vanadate. These properties of the pump are inconsistent with either a mitochondrial or plasma membrane origin.