Zinc deficiency enhanced NAD(P)H-dependent superoxider radical production in plasma membrane vesicles isolated from roots of bean plants

Resumo

A produção de radical superóxido (O2-) foi estudada em vesículas de membrana plasmática isoladas por partição de duas fases de polímero aquoso de raízes de plantas de feijão (Phaseolus vulgaris L. cv. Prélude) com zinco suficiente e deficiente. As duas populações de vesículas foram altamente enriquecidas na membrana plasmática e tiveram composição semelhante, conforme evidenciado pelas enzimas específicas do marcador de membrana. As vesículas de raízes com deficiência de zinco apresentaram taxas mais altas de oxidação de NADPH em comparação com as vesículas de plantas com deficiência de zinco. A formação de O2- dependente de NADPH nas vesículas da membrana plasmática também foi altamente aumentada pela deficiência de zinco. Para ambas as atividades, foi observada uma resposta maior à deficiência de zinco, quando o NADPH foi usado como fonte de elétrons. O reabastecimento de zinco às plantas deficientes por 24 horas diminuiu substancialmente as taxas de oxidação de NADPH e a produção de O2- em vesículas isoladas. A geração de O2 dependente de NADPH foi fortemente estimulada por FAD e apresentou um pH ótimo elevado; foi pouco afetada por Triton X-100 ou mesmo inibida na presença de FAD e foi quase insensível à antimicina A. Os resultados sugerem a presença na membrana plasmática das raízes de feijão de uma atividade geradora de O2-, utilizando preferencialmente NADPH, que é afetada pelo status nutricional de zinco da planta. Essa descoberta, juntamente com observações anteriores sobre frações citosólicas e microssomais preparadas a partir de raízes deficientes em zinco de diferentes plantas, é consistente com a função do zinco na estabilização da membrana por meio do controle do nível de espécies oxidantes de O2.

Abstract

The production of superoxide radical (O2-) was studied in plasma membrane vesicles isolated by aqueous polymer two-phase partitioning from roots of zinc-sufficient and zinc-deficient bean (Phaseolus vulgaris L. cv. Prélude) plants. The two populations of vesicles were highly enriched in plasma membrane and had similar composition as evidenced by the specific membrane marker enzymes. Vesicles from zinc-deficient roots showed higher rates of NAD(P)H oxidation compared to vesicles from zinc-sufficient plants. The NAD(P)H-dependent formation of O2- in plasma membrane vesicles was also highly increased by zinc deficiency. For both activities, a higher response to zinc deficiency was observed when NADPH was used as electron source. Re-supply of zinc to deficient plants for 24 h substantially decreased the rates of NAD(P)H oxidation and O2- production in isolated vesicles. The NADPH-dependent O2- generation was strongly stimulated by FAD and showed a high pH optimum; it was scarcely affected by Triton X-100 or even inhibited in the presence of FAD and was almost insensitive to Antimycin A. The results suggest the presence at the plasma membrane of bean roots of an O2- generating activity, preferentially utilizing NADPH, which is affected by the zinc nutritional status of the plant. This finding, together with previous observations on cytosolic and microsomal fractions prepared from zinc-deficient roots of different plants, is consistent with a role of zinc in membrane stabilization by controlling the level of oxidizing O2 species.