The identification, purification, and characterization of CooJ. A nickel-binding protein that is co-regulated with the Ni-containing CO dehydrogenase from Rhodospirillum rubrum
Resumo
Foi purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado a CooJ, uma proteína que se liga ao níquel do sistema de desidrogenase de monóxido de carbono (CO) da Rhodospirillum rubrum. CooJ é uma proteína induzida por CO, prevista para conter um motivo de ligação ao níquel composto por 16 restos de histidina nos 34 aminoácidos finais da proteína de 12,5 kDa. Quando células cultivadas na presença de CO foram fracionadas em uma coluna de cromatografia de afinidade com metal imobilizado e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, a principal proteína observada no efluente migrou com uma massa molecular aparente de 19 kDa. A proteína de 19 kDa estava ausente em extratos de células cultivadas na ausência de CO e na cepa mutante, UR294, que não possui um gene cooJ funcional. A análise da sequência N-terminal confirmou que a proteína de 19 kDa é o produto do gene cooJ. A CooJ purificada mostrou-se capaz de ligar quatro átomos de níquel por monômero de CooJ com um Kd de 4,3 microM. Outros metais divalentes competiram com a seguinte ordem de afinidade e Ki correspondente: Zn2+ (5 microM) > Cd2+ (19 microM) > Co2+ (23 microM) > Cu2+ (122 microM). CooJ cromatografada em uma coluna de filtração em gel Superose 12 calibrada eluída a 39 kDa, uma posição consistente com uma massa molecular nativa multimérica para CooJ.
Abstract
CooJ, a nickel-binding protein from the CO dehydrogenase system of Rhodospirillum rubrum, was purified by immobilized metal affinity chromatography. CooJ is a CO-induced protein predicted to contain a nickel binding motif composed of 16 histidine residues in the final 34 amino acids of the 12.5-kDa protein. When cells grown in the presence of CO were fractionated on an immobilized metal affinity chromatography column and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the major protein observed in the effluent migrated at an apparent molecular mass of 19 kDa. The 19-kDa protein was absent in extracts of cells grown in the absence of CO and the mutant strain, UR294, which lacks a functional cooJ gene. N-terminal sequence analysis confirmed that the 19-kDa protein is the product of the cooJ gene. Purified CooJ was shown to bind four nickel atoms per CooJ monomer with a Kd of 4.3 microM. Other divalent metals competed with the following order of affinity and corresponding Ki: Zn2+ (5 microM) > Cd2+ (19 microM) > Co2+ (23 microM) > Cu2+ (122 microM). CooJ chromatographed on a calibrated Superose 12 gel filtration column eluted at 39 kDa, a position consistent with a multimeric native molecular mass for CooJ.
R. K. Watt
P. W. Ludden
1998 - Journal of Biological Chemistry
