Ralstonia solanacearum Uses Inorganic Nitrogen Metabolism for Virulence, ATP Production, and Detoxification in the Oxygen-Limited Host Xylem Environment

Resumo

Os dados genômicos preveem que, além do oxigênio, o patógeno bacteriano de plantas Ralstonia solanacearum pode usar nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), óxido nítrico (NO) e óxido nitroso (N2O) como aceptores terminais de elétrons (TEAs). Os genes que codificam a redução do nitrogênio inorgânico foram altamente expressos durante a doença da murcha bacteriana do tomateiro, quando o patógeno cresce nos vasos do xilema. Medições diretas constataram que o fluido do xilema do tomate era pobre em oxigênio, especialmente em plantas infectadas por R. solanacearum. O fluido do xilema continha ~25 mM NO3-, correspondendo à concentração ideal de NO3- de R. solanacearum para o crescimento anaeróbico in vitro. Testamos a hipótese de que a R. solanacearum usa espécies de nitrogênio inorgânico para respirar e crescer durante a patogênese, criando mutantes de deleção que não tinham uma etapa na respiração de nitrato (ΔnarG), desnitrificação (ΔaniA, ΔnorB e ΔnosZ) ou desintoxicação de NO (ΔhmpX). Os mutantes ΔnarG, ΔaniA e ΔnorB cresceram pouco com NO3- em comparação com o tipo selvagem, e apresentaram níveis reduzidos de carga de energia de adenilato sob anaerobiose. Enquanto a respiração de NO3- dependente de NarG aumentou diretamente o crescimento, a redução de NO2- dependente de AniA não o fez. O NO2- e o NO inibiram o crescimento em cultura, e sua remoção dependeu da desnitrificação e da desintoxicação do NO. Assim, o NO3- atua como um TEA, mas o NO2- e o NO resultantes provavelmente não. Nenhum dos mutantes cresceu tão bem quanto o tipo selvagem na planta, e as cepas sem AniA (NO2-redutase) ou HmpX (desintoxicação de NO) tiveram virulência reduzida no tomate. Assim, a R. solanacearum explora o NO3- do hospedeiro para respirar, crescer e causar doenças. A degradação de NO2- e NO também é importante para o sucesso da infecção e depende dos sistemas de desnitrificação e desintoxicação de NO.

IMPORTÂNCIA: a bactéria patogênica para plantas Ralstonia solanacearum causa a murcha bacteriana, uma das doenças mais destrutivas do mundo. O crescimento explosivo desse patógeno no xilema vascular das plantas é pouco compreendido.  Usamos abordagens bioquímicas e genéticas para mostrar que o R. solanacearum esgota rapidamente o oxigênio no xilema do hospedeiro, mas pode então respirar usando o nitrato do hospedeiro como um aceptor de elétrons terminal. O micróbio usa sua via de desnitrificação para desintoxicar as espécies reativas de nitrogênio nitrito (um produto da respiração de nitrato) e óxido nítrico (um sinal de defesa da planta). A desintoxicação pode desempenhar funções sinérgicas na virulência da murcha bacteriana, convertendo a arma química do hospedeiro em uma fonte de energia. As cepas bacterianas mutantes que carecem de elementos da via de desnitrificação não conseguiram crescer tão bem quanto o tipo selvagem em plantas de tomate, e a virulência de alguns mutantes também foi reduzida. Nossos resultados mostram como a atividade metabólica de um patógeno pode alterar o ambiente do hospedeiro de forma a aumentar o sucesso do patógeno.

Abstract

Genomic data predict that, in addition to oxygen, the bacterial plant pathogen Ralstonia solanacearum can use nitrate (NO3−), nitrite (NO2−), nitric oxide (NO), and nitrous oxide (N2O) as terminal electron acceptors (TEAs). Genes encoding inorganic nitrogen reduction were highly expressed during tomato bacterial wilt disease, when the pathogen grows in xylem vessels. Direct measurements found that tomato xylem fluid was low in oxygen, especially in plants infected by R. solanacearum. Xylem fluid contained ~25 mM NO3−, corresponding to R. solanacearum’s optimal NO3− concentration for anaerobic growth in vitro. We tested the hypothesis that R. solanacearum uses inorganic nitrogen species to respire and grow during pathogenesis by making deletion mutants that each lacked a step in nitrate respiration (ΔnarG), denitrification (ΔaniA, ΔnorB, and ΔnosZ), or NO detoxification (ΔhmpX). The ΔnarG, ΔaniA, and ΔnorB mutants grew poorly on NO3− compared to the wild type, and they had reduced adenylate energy charge levels under anaerobiosis. While NarG-dependent NO3− respiration directly enhanced growth, AniA-dependent NO2− reduction did not. NO2− and NO inhibited growth in culture, and their removal depended on denitrification and NO detoxification. Thus, NO3− acts as a TEA, but the resulting NO2− and NO likely do not. None of the mutants grew as well as the wild type in planta, and strains lacking AniA (NO2− reductase) or HmpX (NO detoxification) had reduced virulence on tomato. Thus, R. solanacearum exploits host NO3− to respire, grow, and cause disease. Degradation of NO2− and NO is also important for successful infection and depends on denitrification and NO detoxification systems.

IMPORTANCE: The plant-pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum causes bacterial wilt, one of the world’s most destructive crop diseases. This pathogen’s explosive growth in plant vascular xylem is poorly understood. We used biochemical and genetic approaches to show that R. solanacearum rapidly depletes oxygen in host xylem but can then respire using host nitrate as a terminal electron acceptor. The microbe uses its denitrification pathway to detoxify the reactive nitrogen species nitrite (a product of nitrate respiration) and nitric oxide (a plant defense signal). Detoxification may play synergistic roles in bacterial wilt virulence by converting the host’s chemical weapon into an energy source. Mutant bacterial strains lacking elements of the denitrification pathway could not grow as well as the wild type in tomato plants, and some mutants were also reduced in virulence. Our results show how a pathogen’s metabolic activity can alter the host environment in ways that increase pathogen success.