Endophytes from Gnetum gnemon L. can protect seedlings against the infection of phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum as well as promote plant growth in tomato

Resumo

Endófitos são micróbios benéficos às plantas que as auxiliam produzindo diversas substâncias promotoras de crescimento e atuando como agentes de biocontrole contra vários patógenos. No presente estudo, bactérias endofíticas isoladas de Gnetum gnemon, planta etnomedicinal, foram avaliadas quanto à atividade de promoção do crescimento vegetal (PCV) e ao potencial antagônico contra o patógeno da murcha bacteriana Ralstonia solanacearum. Inicialmente, foram isoladas 40 bactérias endofíticas, agrupadas em 13 grupos com base nos perfis de RFLP e BOX-PCR. Esses 13 isolados representativos pertenciam aos gêneros Bacillus (9), Solibacillus (1), Staphylococcus (2) e Caballeronia (1). Entre eles, seis isolados foram positivos para produção de AIA, com valores de 11,16 a 27,63 μg/mL. Três isolados apresentaram solubilização de fosfato na faixa de 106,4 a 212,7 μg/mL. Oito isolados produziram amônia, com valores de 1,3 a 6,1 μmol/mL. Todos os isolados testados foram positivos para produção de sideróforos. Quanto à produção de enzimas extracelulares, 7 isolados foram positivos para protease, 8 para celulase e 10 para amilase. Os isolados também foram testados quanto à atividade antagônica contra R. solanacearum in vitro e em ensaio in planta com mudas de tomateiro. Staphylococcus warneri GL1 apresentou a maior eficácia de biocontrole (77,67%), seguido de Bacillus velezensis GL3 (70,1%). Os isolados antagônicos a R. solanacearum foram analisados quanto à presença dos genes de biossíntese de peptídeos antimicrobianos bmyB, srfAA, fenD e ituC. Todos os isolados antagônicos apresentaram os quatro genes, exceto Bacillus velezensis GMC2, no qual o gene da fengicina sintetase (fenD) estava ausente. Com base nos atributos de PCV in vitro, três isolados – Bacillus velezensis GL3, Bacillus atrophaeus GMC1 e Bacillus megaterium GS2 – foram selecionados e testados, individualmente e em consórcio, quanto às atividades de PCV in planta em tomateiro. A aplicação de Bacillus velezensis GL3 isoladamente e do consórcio dos três isolados melhorou significativamente parâmetros de crescimento como comprimento da parte aérea, massa fresca e massa seca em experimento em vaso. A colonização da endosfera das mudas de tomateiro tratadas pelo isolado endofítico Bacillus velezensis GL3 foi confirmada pela morfologia das colônias e pelo perfil de BOX-PCR. O estudo destaca o potencial de endófitos associados a plantas pouco exploradas, como G. gnemon, para o desenvolvimento de bioformulações voltadas ao aumento do crescimento vegetal e ao controle da murcha bacteriana.

Abstract

Endophytes are beneficial plant microbes which help the plants by producing various plant growth promoting substances and also by acting as biocontrol agents against various plant pathogens. In the present study, evaluation of endophytic bacteria isolated from Gnetum gnemon, an ethnomedicinal plant was carried out for their plant growth promoting (PGP) activity and antagonistic potential against bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. Initially a total of 40 endophytic bacteria were isolated which were clustered into 13 groups based on RFLP and BOX-PCR fingerprinting. These 13 representative isolates belonged to different genera of Bacillus (9), Solibacillus (1), Staphylococcus (2) and Caballeronia (1). Among them, six isolates were positive for production of IAA, the value of which ranged from 11.16 to 27.63 μg/mL. Phosphate solubilisation in the range of 106.4 to –212.7 μg/mL was shown by three isolates. Eight isolates produced ammonia, the value of which ranged from 1.3 to 6.1 μmol/mL. All tested isolates were positive for siderophore production. For extracellular enzyme production, 7 isolates were positive for protease, 8 for cellulase and 10 for amylase production. The isolates were also tested for their antagonistic activity against R. solanacearum in vitro and in planta assay using tomato seedlings. Staphylococcus warneri GL1 showed the highest biocontrol efficacy of 77.67 % followed by Bacillus velezensis GL3 i.e. 70.1 %. R. solanacearum antagonistic isolates were analysed for the presence of antimicrobial peptide biosynthesis genes bmyB, srfAA, fenD and ituC. All the antagonistic isolates showed the presence of all four genes, except the isolate Bacillus velezensis GMC2, where the gene for fengycin synthetase (fenD) was absent. Based on in vitro PGP traits, three isolates Bacillus velezensis GL3, Bacillus atrophaeus GMC1 and Bacillus megaterium GS2 were selected, these three endophytic bacteria individually and their consortia were tested for in planta PGP activities in tomato plants. Application of Bacillus velezensis GL3 alone and consortia of three isolates showed significant improvement in growth parameters such as shoot length, fresh weight and dry weight in a pot experiment. Colonization of endosphere of treated tomato seedlings by the endophytic isolate Bacillus velezensis GL3 was confirmed by visualization of colony morphology and BOX-PCR fingerprinting. Our study highlights the potential of endophytes associated with unexplored plants like G. gnemon for development of bioformulation aimed at enhancing plant growth and bacterial wilt disease control.