Arabidopsis thaliana high-affinity phosphate transporters exhibit multiple levels of posttranslational regulation

Resumo

Em Arabidopsis thaliana, a família PHOSPHATE TRANSPORTER1 (PHT1) codifica os transportadores de fosfato de alta afinidade. São transcripcionalmente induzidas pela fome de fosfato e requerem FACILITADOR DO TRÁFEGO TRANSPORTADOR DE FOSFATO (PHF1) para sair do retículo endoplasmático (ER), indicando o tráfego intracelular como um nível adicional de regulação da atividade de PHT1. Nosso estudo revelou que o PHF1 age sobre o PHT1, a montante da formação de COPII, uma proteína do revestimento das vesículas, e que eventos reguladores adicionais ocorrem durante o trânsito do PHT1 e determinam sua saída do RE e estabilidade da membrana plasmática. As análises de fosfoproteômica e mutagénese revelaram modulação da exportação do PHT1;1 ER pelo estado de fosforilação do Ser-514. A análise de microscopia confocal das células da ponta da raiz mostrou que o PHT1;1 está localizado na membrana plasmática e está presente nos compartimentos endocíticos intracelulares. Mais precisamente, o PHT1;1 foi localizado em endossomas de triagem associados a compartimentos pré-vacuolares. A análise cinética da estabilidade e do direcionamento de PHT1 sugeriu uma modulação da internalização de PHT1 da membrana plasmática para os endossomos, seguida por reciclagem subsequente (em baixo Pi) ou degradação vacuolar (em alto Pi). Para esta última condição, identificamos um mecanismo rápido que reduz o pool de proteínas PHT1 presentes na membrana plasmática. Este mecanismo é regulado pela concentração de Pi no meio e parece ser independente dos mecanismos de degradação potencialmente regulados pela conjugase de ubiquitina PHO2. Propomos um modelo para o tráfego diferencial de PHT1 para a membrana plasmática ou vacúolo em função da concentração de fosfato.

Abstract

In Arabidopsis thaliana, the PHOSPHATE TRANSPORTER1 (PHT1) family encodes the high-affinity phosphate transporters. They are transcriptionally induced by phosphate starvation and require PHOSPHATE TRANSPORTER TRAFFIC FACILITATOR (PHF1) to exit the endoplasmic reticulum (ER), indicating intracellular traffic as an additional level of regulation of PHT1 activity. Our study revealed that PHF1 acts on PHT1, upstream of vesicle coat protein COPII formation, and that additional regulatory events occur during PHT1 trafficking and determine its ER exit and plasma membrane stability. Phosphoproteomic and mutagenesis analyses revealed modulation of PHT1;1 ER export by Ser-514 phosphorylation status. Confocal microscopy analysis of root tip cells showed that PHT1;1 is localized to the plasma membrane and is present in intracellular endocytic compartments. More precisely, PHT1;1 was localized to sorting endosomes associated with prevacuolar compartments. Kinetic analysis of PHT1;1 stability and targeting suggested a modulation of PHT1 internalization from the plasma membrane to the endosomes, followed by either subsequent recycling (in low Pi) or vacuolar degradation (in high Pi). For the latter condition, we identified a rapid mechanism that reduces the pool of PHT1 proteins present at the plasma membrane. This mechanism is regulated by the Pi concentration in the medium and appears to be independent of degradation mechanisms potentially regulated by the PHO2 ubiquitin conjugase. We propose a model for differential trafficking of PHT1 to the plasma membrane or vacuole as a function of phosphate concentration.