Alkamides: a new class of plant growth regulators linked to humic acid bioactivity

Resumo

O uso de substâncias húmicas como bioestimulantes vegetais tem atraído cada vez mais agricultores e pesquisadores. A capacidade dessas substâncias de aumentar o crescimento radicular alterando a arquitetura radicular está frequentemente ligada às suas atividades hormonais, como efeitos de auxina e produção de óxido nítrico. A análise humeomica acessa os constituintes moleculares das substâncias húmicas, revelando a importância dos componentes alquílicos por suas conformações e atividades químicas. Neste trabalho descrevemos os alcalóides presentes nos ácidos húmicos e comparamos suas bioatividades usando o nível de atividade da membrana plasmática H+-ATPase como marcador bioquímico. Ácidos húmicos isolados de vermicomposto foram analisados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear 13C e 15N. A fração não ligada foi extraída com acetato de etila e submetida à cromatografia  gasosa acoplada à espectrometria de massas para detecção da presença de N-isopropilidedecanamida. Plântulas de milho foram tratadas por 7 e 15 dias com diferentes concentrações. O crescimento radicular e a atividade plasmática da membrana H+-ATPase foram monitorados. O acúmulo de óxido nítrico nas raízes laterais foi fotografado com diacetato de 4,5-diaminofluoresceína. Os resultados foram comparados com os obtidos para plântulas tratadas com ácidos húmicos isolados de vermicomposto. O grupo funcional amida produziu só pela sinal de nitrogênio no espectro de ressonância de ácido húmico 15N, e partes semelhantes de alcamida foram encontradas no extrato húmico não ligado através de comparações usando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. A síntese de N-isopropilidedecanamida apresentou poucos etapas e produziu um alto rendimento (86%). Os efeitos da N-isopropilidededecanamida no crescimento radicular foram dependentes da concentração. Altas concentrações (10⁻⁴ M) aumentaram o crescimento radicular após 15 dias de diminuição da biomassa da parte aérea. No entanto, baixas concentrações (10⁻⁸M e 10⁻⁶ M) promoveram crescimento radicular aos 7 e 15 dias, semelhante à atividade da membrana plasmática H+-ATPase induzida pelo ácido húmico. N-isopropilidedecanamida e ácidos húmicos aumentaram o acúmulo de óxido nítrico durante o surgimento da raiz lateral. Nós descrevemos pela primeira vez os efeitos da N-isopropilidenamida na membrana plasmática H+-ATPase em raízes de plântulas de milho e comparamos seus efeitos com aqueles causados por ácidos húmicos. A N-isopropilidenamida foi detectada na fração não ligada da montagem supramolecular húmica, indicando que os efeitos semelhantes a hormônios putativos dessas substâncias resultam também da presença dessa nova classe de reguladores vegetais, além de outras moléculas.

Abstract

The use of humic substances as plant biostimulants has been increasingly attracting farmers and stunning researchers. The ability of these substances to enhance root growth by changing root architecture is often linked to their hormonal activities, such as auxin effects and nitric oxide production. Humeomics accesses the molecular constituents of humic substances, revealing the importance of alkyl components because of their conformations and chemical activities. Here, we describe the alkamides present in humic acids and compare their bioactivities using plasma membrane H⁺-ATPase activity level as a biochemical marker. Humic acids isolated from vermicompost were analyzed using ¹³C and ¹⁵N nuclear magnetic resonance spectroscopy. The unbound fraction was extracted with ethyl acetate and submitted to gas chromatography coupled to mass spectrometry to detect the presence of N-isopropyldecanamide. We synthesized N-isopropyldecanamide and treated maize seedlings for 7 and 15 days with different concentrations. The root growth and plasma membrane H⁺-ATPase activity were monitored. Nitric oxide accumulation in the lateral roots was imaged using 4,5-diaminofluorescein diacetate. The results were compared with those obtained for seedlings treated with humic acids isolated from vermicompost. The amide functional group produced the only nitrogen signal in the ¹⁵N humic acid resonance spectrum and similar alkamide moieties were found in the unbound humic extract through comparisons using gas chromatography coupled to mass spectrometry. The synthesis of N-isopropyldecanamide had few steps and produced a high yield (86%). The effects of N-isopropyldecanamide on root growth were concentration dependent. High concentrations (10⁻⁴ M) enhanced root growth after 15 day of diminishing shoot biomass. However, low concentrations (10⁻⁸ M and 10⁻⁶ M) promoted root growth at 7 and 15 days, similar to the humic acid-induced plasma membrane H⁺-ATPase activity. Both N-isopropyldecanamide and humic acids enhanced nitric oxide accumulation during lateral root emergence. We described for the first time the effects of N-isopropyldecanamide on the plasma membrane H⁺-ATPase activity in maize seedling roots and compared its effects with those caused by humic acids. N-Isopropyldecanamide was detected in the unbound fraction of the humic supramolecular assembly, indicating that the putative hormone-like effects of these substances result also from the presence of this new class of plant regulators, in addition to other molecules