A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding

Resumo

Um método de determinação de proteínas que envolve a ligação entre proteína e corante. A ligação do corante à proteína
causa uma mudança no máximo de absorção do corante de 465 para 595 nm, e é o aumento da absorção a 595 nm que é monitorizado. Este ensaio é muito reprodutível e rápido com o processo de ligação do corante praticamente completo em
aproximadamente 2 min com boa estabilidade de cor por 1 h. Há pouco ou nenhuma interferência de cátions como sódio ou potássio nem de carboidratos como a sacarose. Uma pequena quantidade de cor é desenvolvida na presença de
agentes tamponantes fortemente alcalinos, mas o ensaio pode ser executado com precisão pelo
uso de controles de buffer apropriados. Os únicos componentes encontrados para dar excessiva
cor interferente no ensaio são quantidades relativamente grandes de detergentes, como
dodecil sulfato de sódio, Triton X-100 e detergentes comerciais para vidraria.
A interferência de pequenas quantidades de detergente pode ser eliminada pelo uso de
controles adequados.

Abstract

A protein determination method which involves the binding of Coomassie
Brilliant Blue G-250 to protein is described. The binding of the dye to protein
causes a shift in the absorption maximum of the dye from 465 to 595 nm, and
it is the increase in absorption at 595 nm which is monitored. This assay is
very reproducible and rapid with the dye binding process virtually complete in
approximately 2 min with good color stability for 1 hr. There is little or no
interference from cations such as sodium or potassium nor from carbohydrates
such as sucrose. A small amount of color is developed in the presence of
strongly alkaline buffering agents, but the assay may be run accurately by the
use of proper buffer controls. The only components found to give excessive
interfering color in the assay are relatively large amounts of detergents such as
sodium dodecyl sulfate, Triton X-100, and commercial glassware detergents.
Interference by small amounts of detergent may be eliminated by the use of
proper controls.