Nitric oxide generated by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae drives plant infection

Resumo

O óxido nítrico (NO) derivado das plantas, desencadeia a defesa preparando o início da resposta hipersensível e restringindo a entrada de patógenos durante a incompatibilidade. No entanto, pouco se sabe sobre a função do NO produzido pelo patógeno durante o desenvolvimento e a infecção pré-infecção. Buscamos evidências da produção de NO pelo fungo da brusone do arroz durante o início da infecção. A produção de NO foi medida usando a fluorescência de DAR-4M e a função do NO foi avaliada usando removedores de NO. A síntese de NO foi investigada por meio do nocaute direcionado de genes potencialmente envolvidos na síntese de NO, incluindo genes semelhantes à óxido nítrico sintase (NOL2 e NOL3) e nitrato (NIA1) e nitrito redutase (NII1), gerando mutantes simples e duplos Δnia1Δnii1, Δnia1Δnol3 e Δnol2Δnol3. Demonstramos que o Magnaporthe oryzae gera NO durante a germinação e no início do desenvolvimento. A remoção do NO atrasa o desenvolvimento da germinação e reduz o número de lesões da doença. O NO não é gerado pelas proteínas candidatas testadas, nem por outros sistemas de NO dependentes de arginina, pela atividade da poliamina oxidase ou não enzimaticamente pelo pH baixo. Além disso, mostramos que, embora NIA1 e NII1 sejam essenciais para a assimilação de nitrato, NIA1, NII1, NOL2 e NOL3 são todos dispensáveis para a patogenicidade. O desenvolvimento de M. oryzae e o início da infecção dependem de forma crítica da síntese de NO fúngico, mas seu modo de geração permanece obscuro.

Abstract

Plant-derived nitric oxide (NO) triggers defence, priming the onset of the hypersensitive response and restricting pathogen ingress during incompatibility. However, little is known about the role of pathogen-produced NO during pre-infection development and infection. We sought evidence for NO production by the rice blast fungus during early infection. NO production was measured using fluorescence of DAR-4M and the role of NO assessed using NO scavengers. The synthesis of NO was investigated by targeted knockout of genes potentially involved in NO synthesis, including nitric oxide synthase-like genes (NOL2 and NOL3) and nitrate (NIA1) and nitrite reductase (NII1), generating single and double Δnia1Δnii1, Δnia1Δnol3, and Δnol2Δnol3 mutants. We demonstrate that Magnaporthe oryzae generates NO during germination and in early development. Removal of NO delays germling development and reduces disease lesion numbers. NO is not generated by the candidate proteins tested, nor by other arginine-dependent NO systems, by polyamine oxidase activity or non-enzymatically by low pH. Furthermore, we show that, while NIA1 and NII1 are essential for nitrate assimilation, NIA1, NII1, NOL2 and NOL3 are all dispensable for pathogenicity. Development of M. oryzae and initiation of infection are critically dependent on fungal NO synthesis, but its mode of generation remains obscure.