Anion-Sensitive, H⁺-Pumping ATPase of Oat Roots1: Direct Effects of Cl⁻, NO₃⁻, and a Disulfonic Stilbene

Resumo

Para entender o mecanismo e as propriedades moleculares da ATPase do tipo tonoplasto H+-translocadora, estudamos o efeito de Cl−, NO3− e ácido 4,4′-diisocianato-2,2′-estilbeno dissulfônico (DIDS) na atividade da H+-ATPase eletrogênica associada a vesículas microsomais de baixa densidade de raízes de aveia (Avena sativa cv Lang). A ATPase que bombeia H+ gera um potencial de membrana (Δψ) e um gradiente de pH (ΔpH) que compõem dois componentes interconvertíveis do gradiente eletroquímico de prótons (Δ̄μh+). Um ânion permeante (por exemplo, Cl−), ao contrário de um ânion impermeante (por exemplo, iminodiacetato), dissipou o potencial de membrana (distribuição de [14C]tiocianato) e estimulou a formação de um gradiente de pH (distribuição de [14C]metilamina). No entanto, a atividade da ATPase estimulada por Cl− foi cerca de 75% causada por uma estimulação direta da ATPase por Cl−, independente do gradiente eletroquímico de prótons. Ao contrário da H+-ATPase da membrana plasmática, a ATPase estimulada por Cl− foi inibida por NO3− (um ânion permeante) e por DIDS. Na ausência de Cl−, NO3− diminuiu a formação do potencial de membrana e não estimulou a formação do gradiente de pH. A inibição por NO3− da formação do gradiente de pH estimulada por Cl− e da atividade da ATPase estimulada por Cl− foi não competitiva. Na ausência de Cl−, DIDS inibiu a atividade basal da Mg,ATPase e a formação do potencial de membrana. DIDS também inibiu a atividade da ATPase estimulada por Cl− e a formação do gradiente de pH. A inibição direta da H+-ATPase eletrogênica por NO3− ou DIDS sugere que a ATPase que bombeia H+ insensível ao vanadato possui sítios sensíveis a ânions que regulam a atividade catalítica e vetorial. Ainda não se sabe se a H+-ATPase sensível a ânions possui canais que conduzem ânions.

Abstract

To understand the mechanism and molecular properties of the tonoplast-type H+-translocating ATPase, we have studied the effect of Cl−, NO3−, and 4,4′-diisothiocyano-2,2′-stilbene disulfonic acid (DIDS) on the activity of the electrogenic H+-ATPase associated with low-density microsomal vesicles from oat roots (Avena sativa cv Lang). The H+-pumping ATPase generates a membrane potential (Δψ) and a pH gradient (ΔpH) that make up two interconvertible components of the proton electrochemical gradient (Δ̄μh+). A permeant anion (e.g. Cl−), unlike an impermeant anion (e.g. iminodiacetate), dissipated the membrane potential ([14C]thiocyanate distribution) and stimulated formation of a pH gradient ([14C]methylamine distribution). However, Cl−-stimulated ATPase activity was about 75% caused by a direct stimulation of the ATPase by Cl− independent of the proton electrochemical gradient. Unlike the plasma membrane H+-ATPase, the Cl−-stimulated ATPase was inhibited by NO3− (a permeant anion) and by DIDS. In the absence of Cl−, NO3− decreased membrane potential formation and did not stimulate pH gradient formation. The inhibition by NO3− of Cl−-stimulated pH gradient formation and Cl−-stimulated ATPase activity was noncompetitive. In the absence of Cl−, DIDS inhibited the basal Mg,ATPase activity and membrane potential formation. DIDS also inhibited the Cl−-stimulated ATPase activity and pH gradient formation. Direct inhibition of the electrogenic H+-ATPase by NO3− or DIDS suggest that the vanadate-insensitive H+-pumping ATPase has anion-sensitive site(s) that regulate the catalytic and vectorial activity. Whether the anion-sensitive H+-ATPase has channels that conduct anions is yet to be established.