The potent activity of sulfated polysaccharide, ascophyllan, isolated from Ascophyllum nodosum to induce nitric oxide and cytokine production from mouse macrophage RAW264. 7 cells: Comparison between ascophyllan and fucoidan

Resumo

O ascofilano isolado da alga marrom Ascophyllum nodosum é um polissacarídeo sulfatado contendo fucose, que possui composição monossacarídica característica semelhante, mas distinta, e estrutura química completa ao fucoidan. Neste estudo, examinamos os efeitos de ascofilano, fucoidano isolado de A. nodosum (A-fucoidan) e fucoidano de Sigma (S-fucoidan) como um fucoidano representativo derivado de outra fonte (Fucus vesiculosus) na linha celular de macrófagos de camundongo RAW264 .7. Não foram observados efeitos citotóxicos significativos de ascofilano e A-fucoidan em células RAW264.7 até 1000 μg/ml, enquanto o S-fucoidan mostrou efeito citotóxico de maneira dependente da concentração. O ascofilano induziu um nível extremamente mais alto de produção de óxido nítrico (NO) a partir de células RAW264.7 do que aqueles induzidos por fucoidanos na faixa de concentração testada (0–200 μg/ml). A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) e a análise de western blot revelaram que o nível de expressão da NO sintase induzível (iNOS) em células RAW264.7 tratadas com ascofilano foi muito maior do que os níveis detectados nas células tratadas com fucoidanos. Além disso, as atividades do ascofilano para induzir a secreção do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e do fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) das células RAW264.7 também foram maiores do que aquelas induzidas pelos fucoidanos, especialmente na faixa de concentração mais baixa (3,1–50 μg/ml). As atividades do ascofilano para induzir a produção de NO e citocinas em macrófagos peritoneais de camundongos também foram mais fortes do que as dos fucoidanos. O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) usando o fator nuclear kappa B (NF-κB) marcado com corante infravermelho e as sequências de consenso AP-1 sugeriram que o ascofilano pode ativar fortemente esses fatores de transcrição. Aumento acentuado na translocação nuclear de p65, e a fosforilação e degradação de IκB-α também foram observados em células RAW264.7 tratadas com ascofilano. A análise usando inibidores da proteína quinase ativada por mitógeno (MAP) e a análise de western blot sugeriram que a quinase N-terminal c-Jun (JNK) e a MAP quinase p38 estão envolvidas principalmente na produção de NO induzida por ascofilano.

Abstract

Ascophyllan isolated from the brown alga Ascophyllum nodosum is a fucose-containing sulfated polysaccharide, which has similar but distinct characteristic monosaccharide composition and entire chemical structure to fucoidan. In this study, we examined the effects of ascophyllan, fucoidan isolated from A. nodosum (A-fucoidan), and fucoidan from Sigma (S-fucoidan) as a representative fucoidan derived from other source (Fucus vesiculosus) on mouse macrophage cell line RAW264.7 cells. No significant cytotoxic effects of ascophyllan and A-fucoidan on RAW264.7 cells were observed up to 1000 μg/ml, while S-fucoidan showed cytotoxic effect in a concentration-dependent manner. Ascophyllan induced extremely higher level of nitric oxide (NO) production from RAW264.7 cells than those induced by fucoidans over the concentration range tested (0–200 μg/ml). Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot analysis revealed that expression level of inducible NO synthase (iNOS) in ascophyllan-treated RAW264.7 cells was much higher than the levels detected in the cells treated with fucoidans. Furthermore, the activities of ascophyllan to induce the secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) from RAW264.7 cells were also greater than those induced by fucoidans especially at lower concentration range (3.1–50 μg/ml). The activities of ascophyllan to induce NO and cytokine production in mouse peritoneal macrophages were also stronger than those of fucoidans. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using infrared dye labeled nuclear factor-kappa B (NF-κB) and AP-1 consensus sequences suggested that ascophyllan can strongly activate these transcription factors. Marked increase in the nuclear translocation of p65, and the phosphorylation and degradation of IκB-α were also observed in ascophyllan-treated RAW264.7 cells. Analysis using mitogen-activated protein (MAP) kinase inhibitors and western blot analysis suggested that c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 MAP kinase are mainly involved in ascophyllan-induced NO production.